ChIPSeq技术在转录因子结合位点分析的应用样稿

ChIP-Seq技术在转录因子结合位点分析应用

摘要：染色质免疫沉淀(Chromatinimmunoprecipitaion, ChIP)技术是用来研究细胞内特定基因组区域特定位点和结合蛋白相互作用技术。将ChIP和第二代高通量测序技术相结合染色质免疫沉淀测序(chromatinimmunoprecipitation followed bysequencing，ChIP-Seq)技术能在短时间内取得大量研究数据，高效地在全基因组范围内检测和组蛋白、转录因子等相互作用DNA区段，在细胞基因表示网络研究中发挥关键作用。本文简明介绍了ChIP-Seq技术基础原理、试验设计和后续数据分析，和ChIP-Seq技术在研究转录因子结合位点中。

关键词：ChIP-Seq；转录因子；

引言

染色质是真核生物基因组DNA关键存在形式，为了说明真核生物基因表示机制，对于蛋白质和DNA在染色质环境下相互作用研究是基础路径。转录因子是参与基因表示一类关键细胞核蛋白质，基因转录是生物基因表示层次中最关键一层，转录因子经过特异性结合区域DNA序列来基因转录过程。转录因子由基础转录因子和性转录因子两类组成，其中基础转录因子在转录起始位点周围开启子区，和RNA聚合酶相互作用实现基因转录；而性转录因子通常和位置多样增强子序列结合，再经过形成增强体在组织发育、细胞分化等基因表示水平中发挥极其关键作用[1]。

ChIP-Seq是多年来新兴将ChIP和新一代测序技术相结合，在全基因s组范围内分析转录因子结合位点(transcriptionfactor binding sites，TFBS)、组蛋白修饰(histonemodification)、核小体定位(nucleosomepositioning)和DNA甲基化(DNAmethylation)高通量方法[2-4]。其中ChIP是全基因组范围内识别DNA和蛋白质体内相互作用标准方法[5]，最初用于组蛋白修饰研究[6]，以后用于转录因子[7]。同时，新一代测序技术迅猛发展也将基因组学水平研究带入了一个新阶段，使得很多基于全基因组研究成为可能。相对于传统基于芯片ChIP-chip(chromatin immunoprecipitation combined with DNA tilingarrays)，ChIP-seq提供了一个高分辨率、低噪音、高覆盖率研究蛋白质-DNA相互作用手段[8]，能够应用到任何基因组序列已知物种，能够研究任何一个DNA相关蛋白和其靶定DNA之间相互作用，并能确切得到每一个片段序列信息．伴随测序成本降低，ChIP-seq逐

步成为研究基因和表观遗传机制一个常见手段。另外，为了达成愈加好检测效果和更为完整信息，多年来，将ChIP-Seq和ChIP-chip二者融合研究含有很好应用前景[9,10]。

转录因子在器官发生过程中起至关关键作用，在全基因组水平将转录因子定在靶基因DNA是认识转录网络有效方法之一，了解基因转录关键是识别蛋白质和DNA相互作用。ChIP-Seq技术能够揭示转录因子结合位点和确定直接靶基因序列，可在体内分析特定开启子分子机制，所以被广泛应用于转录机制研究。本文关键就这一技术在转录因子结合位点研究中基础原理、试验设计和数据分析等技术层面、和实际应用层面进行讨论。

1ChIP-seq 基础原理及试验设计

1.1ChIP 技术

蛋白质和DNA相互识别是基因转录关键，也是开启基因转录前提。ChIP是在全基因组范围内检测DNA和蛋白质体内相互作用标准方法[11］，该技术由Orlando等[12］于1997年创建，最初用于组蛋白修饰研究，以后广泛应用到转录因子作用位点研究中[13］。ChIP基础原理为：活细胞采取甲醛交联后裂解，染色体分离成为一定大小片段，然后用特异性抗体免疫沉淀目标蛋白和DNA交联复合物，对特定靶蛋白和DNA片段进行富集[8]。采取低pH值反交联，DNA和蛋白质之间Schiff键(-C=N-)水解，释放DNA片段。经过对目标片段纯化和检测，取得DNA和蛋白质相互作用序列信息。

N-ChIP[14］和X-ChIP[15]是最常见2种ChIP试验技术，前者用来研究DNA和高结协力蛋白相互作用，采取核酸酶消化染色质，适适用于组蛋白及其异构体研究；X-ChIP关键用来研究DNA和低结协力蛋白相互作用，采取甲醛或紫外线进行DNA和蛋白交联，然后，采取超声波将染色质断裂为小片段，适适用于多数非组蛋白蛋白质类研究。因为生物芯片含有快速、高效、高并行性、高通量、微型化和自动化等特点，高密度生物芯片和ChIP结合极大地方便了DNA和蛋白质相互作用研究。

1.2ChIP-Seq 技术

ChIP-Seq是将ChIP和新一代测序技术相结合，能够高通量地得到每一个片段正确序列信息，其试验原理是：在生理状态下，把细胞内DNA和蛋白质交联后裂解细胞，分离染色体，经过超声或酶处理将染色质随机切割，利用抗原抗体特异性识别反应，将和目标蛋

白质相结合DNA片段和目标蛋白质沉淀下来，再经过反交联（ReverseCrosslink）释放结合蛋白DNA片段。此步骤取得全基因组范围内和组蛋白或转录因子等DNA结合蛋白相互作用DNA区段信息，这些DNA区段信息长度大约为200bp. 用新一代测序技术测序取得36～100bpDNA 片段序列，最终这些DNA片段将会被比对到对应参考基因组上（图1）［16］。

图1ChIP-Seq 试验原理图

同ChIP-Seq技术和ChIP-chip比较起来，它最大优点在于能够正确定量分析。该技术含有很多优点：（1）能实现真正全基因组分析；（2）结合分辨率可正确到10～30bp；（3）所需样本量小；（4）避免了杂交等影响原因，含有更高敏感性等。

现在，分析ChIP-Seq测序平台关键有454、Solexa、IIIumina、SOLiD和HeliScope，其中IIIumina测序是最常使用测序方法。ChIP-Seq技术读取序列越来越多，而成本也在不停下降。通常第二代高通量测序方法产生是段序列，段序列在序列拼接和序列映射时会产生很多麻烦，不过在ChIP-Seq试验中，段序列含有很大价值，因为序列结合位点通常全部比较短。

2ChIP-Seq 数据分析

ChIP-Seq难点是测序后生物信息学分析，DNA打坏方法、染色质开放程度不均一性、PCR扩增偏向性、基因组反复程度和测序和序列比对过程中错误全部会引入系统误差造成假阳性，尽可能剔除假阳性并揭示出数据背后机制是需要分子生物学和计算生物学工作者协同努力。对ChIP-Seq数据处理关键分为四个部分：数据预处理、序列比对、峰值检测和模体分析。

2.1ChIP-seq 数据格式及预处理

现在，IIIumina企业测序仪产出测序数据基础全部是FASTQ格式，即一个含有测序质量FASTA文件[17]。FASTQ格式以测序读段为单位存放，每条读段占四行，第一行开头为“@”后接读段标识，第二行为测序出碱基序列，第三行开头为“+”后接读段ID，因读段ID通常和第一行相同，所以有时能够省略以节省空间。第四行为测序质量，通常见字符表示，长度和第二行相同，对应于对应位置碱基测序质量。因为测序仪器会得到较低质量数据，为了去除部分低质量数据需要进行预处理。

另外，原始数据也能够从基因表示综合数据库GEO(GeneExpression Omnibus)中下载得到。GEO是NCBI下一个基因表示大型数据库，其最大功效是用来储存和检索公开高通量基因表示和基因组杂交数据。当文章在科学文件上发表后，其中所产生高通量试验数据就将放在公有领域上，供其它研究者无偿下载，使得试验数据中海量信息能够被数次分析和深入挖掘。和此同时，部分文章会将数据传送到序列存档库SRA（SequenceRead Archive）。SRA数据库数据集包含数据上传时间，标题，物种，试验类型，文章引用，试验设计，下载地址，数据大小等信息。

2.2 序列比对

因为单核苷酸多态性存在，在短序列比对[18]时候必需要许可1-3个匹配错误，比正确时候对于不能唯一比对到基因组序列，能够去掉或允很多重比对，通常，多重比对带来较高敏感度，因为它许可我们检测较低覆盖度区域。

现在有多个序列比对工具，不过Bowtie[19]是其中最快而内存应用效率很高佼佼者（表1），它采取一个称作Burrow-Wheeler变换(BWT)压缩算法对参考基因组序列进行索引，使用大约2.2GB（2.9GB 用于双末端测序）内存，就可完成人类基因组序列比对。每小时能够比对超出25,000,000段长度为35bpDNA 序列。Bowtie还能够同时开启多个线程来加紧速度，这对于多核CPU来说尤为关键。尽管大部分软件全部许可在比对中插入间隙，不过对于ChIP-Seq试验来说，寻求单核苷酸多态性或插入和缺失并不是关键。唯一序列占整体序列数量百分比是分析人员需要关键考虑问题。

表1序列比对步骤中部分常见软件

列长度受限。

BWA[21] MAQ[22] SOAP[23]	基于 BWT(Burrows-Wheeler transform)算法；运算快速高效，比对过程中许可适度插入和缺失。 比对过程中不许可碱基空缺，但能考虑到每个碱基质量指数。 比对过程中许可少许碱基空缺和错配。
Bowtie	基于BWT 算法；速度超快，且含有高存放效率。

不管从哪个方面来看，Bowtie全部很适宜，所以本步骤采取Bowtie完成序列比对这项工作。经过比对以后，原始测序读段将带有其在基因组中位置信息，或说，该测序读段被回贴到了基因组中。

2.3 峰值检测

峰值检测是ChIP-Seq数据分析一个关键步骤，很多后续分析全部取决于峰值检测结果。峰值检测是依据峰富集区域来估计DNA结合蛋白在基因组上结合区域。不一样DNA结合蛋白在基因组上分布模式是不一样，具体表现于ChIP-Seq峰形不一样，如转录因子峰型为尖锐状，即信号高度集中。峰值检测是一个用于判别读段数尤其集中区域手段，表2列举了ChIP-Seq数据分析过程峰检测步骤中常见到软件。在峰值检测过程中，需要综合考虑灵敏度和特异度之间平衡，因为增加灵敏度将降低特异度，增加特异度将降低灵敏度。只有针对不一样DNA结合蛋白选择适宜峰值检测算法和数据标准化方法，才能取得灵敏度和特异度之间最好平衡。

表2峰值检测步骤中部分常见软件

2.4 模体分析

模体就是DNA、蛋白质等生物大分子中保守序列。每种转录因子全部含有不一样模体特征。本文分析比较了3种不一样分析平台DMINDA，MEME和CisGenome。

DMINDA是一个Webserver 软件[27]，能够使用云计算，立即数据提交到网页服务器进行分析处理，也含有对应用户端程序，关键运行在Windows系统下，含有处理数据快，模体分析单一性强等特点。数据经过序列比对和峰值检测以后，在经过深入处理以后，就能够使用DMINDA进行模体分析。模体分析DMINDA软件使用步骤和结果显示图2所表示。

图2(A)DMINDA 主页面，选择模体分析；(B)上传数据，设置参数，提交即可开始运算；(C) 显示模体分析结果

MEME[28]也是一个综合性强而且应用广泛一个WebServer 软件，一样也是能够在线处理数据和用户端处理数据（关键运行于Uinix）。MEME网页版含有不足，上传峰数目不能超出1000条，全部脱氧核苷酸总数不能超出600000个，当使用用户端软件时无任何。

即使MEME软件处理数据速度相对缓慢，但其含有可信度较高、结果稳定等特点，现在应用比较广泛。模体分析MEME软件使用步骤和结果显示图3所表示。

图3(A)MEME 主页面，选择模体分析；(B)上传数据，设置参数，提交即可开始运算；(C)显示模体分析结果

CisGenome[29]是一款综合性分析软件，现在关键用于分析ChIP-chip和ChIP-Seq数据，其独特模块化设计开创了可视化用户界面和数据自定义批量处理功效，支持数据间交互式分析。另外，CisGenome浏览器是经典当地版基因组浏览器，全部数据、注释信息全部存于当地文件，所以不需要网络连接，方便内部考查数据用。借助CisGenome来处理ChIP-Seq海量数据将会事半功倍。CisGenome优点在于软件图形化，该软件运行于Windows系统之上，界面简单，操作简便，但肯定会带来运行缓慢。模体分析GisGenome软件使用步骤和结果显示图4所表示。

图4(A)GisGenome 上传数据，设置参数，提交即可开始运算；(C)显示模体分析结果

3基于ChIP-Seq转录因子结合位点研究

转录因子是一类很关键蛋白质分子，其能够经过和DNA结合，部分下游效应分子，引发一系列级联反应，从而发挥强大生物学作用．全基因组范围内明确这些转录因子结合位点是揭示这些转录因子生物学功效和机制基础，同时也是绘制基因网络不可缺乏部分。

肝脏是一以代谢功效为主器官，同时也制造消化系统中胆汁。Wederell[30]等研究成年小鼠肝脏组织中转录因子Foxa2结合位点，一共识别了11000个位点，其中近二分之一肝脏表示基因含有相关Foxa2结合位点。Schmidt等[31]利用ChIP-Seq技术研究多个脊椎动物肝脏中表示两个转录因子CEBPA和HNF4A，即使两个转录因子全部有高度保守DNA结合结构域，绝大多数情况下表现出特异性。Bochkis等[32]经过ChIP-Seq全基因组定位分析高度同源转录因子Foxa1和Foxa2，发觉即使Foxa1和Foxa2肝脏中结合位点大部分重合，在体内它们各自还有跟其它元件结合。肝脏发育经历了一系列内胚层和中胚层之间复杂相互作用，在Xu等[33]先前研究中应用ChIP-Seq技术发觉了Foxa2在DE细胞全基因组中结合位点，并在全基因组水平上证实Foxa2含有先锋因子作用，且Foxa2对特异靶基因作用是经过修饰靶基因片段中H3K4me2组蛋白位点实现。，Hansook等[34]利用ChIP-Seq分析转录因子FXR在肝细胞染色质中结合，发觉一个额外核受体半位点和FXR结合。以后，Hansook等[35]又分析了LRH-1在全基因组中结合位点，深入证实了在整个基因组范围内

LRH-1和FXR含有相互作用。另外，分析结果还表明，LRH-1结合基因位点和FXR结合位点靠近。LRH-1/FXR共同结合基因全部和脂质代谢相关。这些结果表明，LRH-1招募FXR激活脂质代谢相关基因表示。研究还发觉，部分FXR跟LRH-1没有共同结合域，表面FXR可能跟RORs和NR3As家族组员相互作用，调整其它代谢路径。

细胞核接头蛋白LDB1是多蛋白转录复合体中一个关键成份。Li等[36]发觉，在小鼠胚胎和成体造血干细胞中LDB1起到关键作用。在造血干细胞和前体细胞中敲除该基因会造成部分维持多能性相关基因转录下调，ChIP-Seq结果显示，LDB1形成复合体结合在这些基因开启子区域，暗示LDB1维持造血干细胞中起关键作用。多能造血前体细胞是一个干细胞样细胞，表示多种基因，且有分化成包含免疫系统细胞在内大量不一样类型血细胞能力。Zhang等[37]利用ChIP-Seq技术在小鼠全基因组内找出造血前体细胞转化成定型T细胞中起作用全部基因，并确定了每个基因在发育过程中转录时间点。Olig2是一个少突胶质细胞转录因子，和前体细胞增殖和向少突胶质细胞分化亲密相关。Yu等[38]利用ChIP-Seq进行全基因组分阶段研究发觉Olig2充当了一个预定位因子，引导染色质重塑酶抵达少突胶质细胞活性靶点，从而激活少突胶质细胞特定基因表示。Ouyang等[39]利用ChIP-Seq技术研究小鼠胚胎干细胞，发觉大约有65%基因表示是由12个转录因子。她们判定了两组转录因子。其中第一组通常作为激活剂起作用，第二组可能依靠于靶点不一样或作为激活剂，或作为抑制剂。这两组转录因子紧密协作，激活胚胎干细胞中差异化上调基因。在缺乏第一组转录因子结合时，第二组转录因子结合胚胎干细胞中被抑制基因及早期分化中去抑制基因。

4结论和展望

现在，ChIP-Seq已广泛应用于研究部分经典转录因子和部分新转录因子在全基因组上结合情况，实现全基因组层面分析部分经典转录因子网络，或为新转录因子功效研究提供部分线索。研究人员可经过分析这些转录因子结合序列特征发觉它们经典作用基序或协同作用因子。研究人员亦可经过分析这些转录因子在基因组上位置分布情况来拓展其基因作用。之前认为转录因子通常分布在基因开启子区和增强子区，然而经过ChIP-chip和ChIP-Seq考察部分转录因子在基因组上分布情况，发觉有些转录因子结合位点分布在远离已知基因TSS位置或广泛分布在整个基因组上，这可能暗示新靶基因或新机制存在。另外，经过比较某转录因子在不一样阶段或不一样状态组织或细胞中靶定位点差

异，研究人员还可分析该转录因子在细胞不一样阶段或不一样状态下不一样作用。ChIP-

Seq等技术经过系统整合DNA和蛋白质相互作用数据，在揭示基因表示若干机制及构

建愈加具体基因表示网络图谱中发挥无可替换作用。

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